抗菌檢測方法論

時間:2018-12-20 00:29:25 來源:CIAA 點擊量:

毛潔紅 胡國華 喬競奇 唐閔
TÜV南德意志集團 品升商品檢測(上海)有限公司
TÜV SÜD PSB Products Testing (Shanghai) Co., Ltd
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要:簡述了國內外抗菌產品和抗菌劑的檢測現狀,比較了各種檢測方法的異同、適用范圍和局限性;重點針對部分抗菌劑和抗菌產品,列舉了新開發的測試方法,以及這些方法的優缺點。
關鍵詞:檢測 抗菌劑 新型方法
 
前言
隨著工業的迅速發展和人民生活水平的提高,人們對環境和自我健康日益重視,特別是SARS和禽流感后,人們更加重視抗菌劑及抗菌產品的開發和研制。由于抗菌劑和抗菌產品的多樣性,很難用統一的方法來評價其真實的抗菌效果。了解國內國際抗菌產品和殺菌劑的檢測方法,有助于企業正確和科學評價產品抗菌性能,提高產品的競爭性
 
術語
抑菌:防止或抑制微生物生長繁殖的作用;
殺菌:殺死微生物營養體和繁殖體的作用;
殺菌值(率):菌和樣品接觸一定時間前后活菌對數值之差或菌減少百分比。
抑菌值(率):菌和標準樣品及已處理的抗菌樣品接觸一定時間后的活菌對數值之差,或菌減少百分比;
 
1. 抗菌劑的檢測
1.1抗菌劑的分類
抗菌劑:指能夠在一定時間內,使某些微生物(細菌、真菌、酵母菌、藻類及病毒等)的生長或繁殖保持在必要水平以下的化學物質。
抗菌劑大致分為有機抗菌劑和無機抗菌劑兩大類:
無機抗菌劑以銀、鋅、銅等為主原料,以無機填料為載體,制成無機抗菌劑,耐高溫性能好;有有機抗菌劑以酯類、醇類、酚類為主要原料,耐高溫性較低,一般在200℃以下,個別為300℃,殺菌時間短,偶有析出等現象。
1.2抗菌劑的檢測
抗菌劑的檢驗方法也是有很多種, 常見的評價方法為最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)
1.2.1試管法
優點:操作簡單,對儀器沒有太嚴格要求
缺點:判斷結果的人為因素大,不夠精準,樣品用量大;
在消毒技術規范里面有介紹。
將樣品稀釋成不同濃度,加入到無菌試管中,在每個試管中加入一定濃度的測試菌,培養一定時間后肉眼觀察培養液的混濁情況,如果是澄清的,說明沒有細菌的增長,即細菌的生長得到了抑制。然后將所有澄清管都分別劃線在培養基表面,若無細菌生長,則說明測試的菌已經被殺滅。以此來判斷該樣品的最小殺菌濃度和最小抑菌濃度。
樣品A 測試菌種
金黃色葡萄球菌ATCC 6538
Con. MIC
6.25ppm C/C/C
3.12ppm C/C/T
1.56ppm T/T/T
0.78ppm T/T/T
樣品A試管法MIC結果:3.12ppm
1.2.2 96孔板-酶標儀法
優點:機器判讀結果,精準度高,樣品量少;
缺點:對實驗室儀器要求較高;
可以根據不同的樣品選擇不同的方法,針對比較貴重的樣品,或樣品量少的情況,可以選用96孔板的方法,這個方法對樣品的用量很少,最終的結果是用酶標儀來讀取OD值,相對而言,比用肉眼觀察澄清度來得更為精準。
將樣品稀釋到測試起始濃度后進行用多通道移液槍移取到96孔板中,然后對樣品依次進行對倍稀釋,稀釋結束后加入測試進行培養,培養后上酶標儀讀取OD值,未生長的濃度點即為該樣品MIC值;將所有未生長的濃度梯度孔劃線分離于固體培養基上并培養,無菌落生長的濃度即為該樣品的MBC值。
 
96-孔板法
樣品A (金黃色葡萄球菌ATCC 6538 )
Con
(ppm)
Blank 6.25 3.12 1.56 0.78 Growth Control
A 0.046 0.048 0.048 0.166 0.225 0.215
B 0.047 0.046 0.048 0.163 0.242 0.218
C 0.047 0.046 0.047 0.166 0.208 0.206
D 0.046 0.047 0.046 0.181 0.227 0.211
E 0.049 0.047 0.047 0.173 0.204 0.218
F 0.046 0.045 0.046 0.162 0.218 0.205
G 0.047 0.045 0.045 0.168 0.208 0.213
H 0.047 0.043 0.044 0.167 0.218 0.208
樣品A 96孔板法MIC結果:3.12ppm
比較上述兩種方法:
 
1)    96孔板法的樣品用量僅為試管法的1/6。針對一些比較貴重的樣品可選擇96孔板的方法。
2)    96孔板一塊板上可同時操作10個濃度,2個對照樣,8個平行,儀器讀數,結果的準確度相比較試管法大大提高。
 
3. 抗菌產品的檢測
抗菌產品的檢測一般分定性、定量和現場模擬等三種方法:
定性方法:對產品的抗菌性能進行定性的判斷,相對較籠統,操作簡單。
定量方法:對產品的抗菌性能進行定量的檢測,給出產品的具體抑/殺菌參數,能更清楚地了解產品的抗菌性能,可表示為產品的殺菌率(%),殺菌活性值(對數減少值)等。
現場模擬實驗法:模擬產品的真實使用情況來評估其抗菌的功能。
 
抗菌產品根據應用領域的不同大致可以分成幾大類:紡織品、高分子塑料產品、日化衛生用品和消毒劑和涂料等。針對不同的產品類型國際和國內都有不少相應的檢測方法,如:
3.1 紡織品:AATCC100; AATCC147; AATCC30; JIS L 1902; EN ISO 20645; EN ISO 20743; EN 14119; GB/T 20944.1.2; GB 15979; FZ/T 62015; FZ/T 73023等。
3.2高分子塑料產品、涂料:ISO22196; JIS Z 2801; ISO 846; ASTM G21; QB/T 2591等。
3.3日化衛生用品和消毒劑:EN1500;EN1276; EN 1040; GB 15981;GB/T 19877.3;消毒技術規范等。
3.4 涂料: USP <51>; EP 5.1.3,做成涂片后也可參照塑料產品的檢測方法進行評價。
 方法的不同直接導致測試的結果及評定的標準也將不同。
 
4.抗菌產品的檢測常見的評價方法主要有以下2種:
4.1殺菌值(率)
4.2抑菌值(率)
4.3模擬評價法
4.1.1殺菌率為抗菌產品接觸一定數量污染菌后,在確定的時間內細菌減少百分比或細菌對數值減少級別。
在這個實驗中,接觸時間的確定是很重要的,不同的接觸時間可以得到不同的實驗結果。
接觸時間可根據產品的用途來確定,例如消毒劑、洗手液,通常接觸的時間僅為1-10分鐘;抗菌紡織品,塑料制品建議的接觸時間為18-24小時,許多材料無法提供細菌持續生長所需要的營養成分,污染菌在接觸24小時后,細菌會發生自然衰亡的情況,所以實驗中接觸時間通常不超過24小時。 
4.2.1當細菌減少的數量不是和原始污染菌的濃度進行比較,而是和同材質沒有抗菌處理的對照樣品經過同樣接觸時間后殘留的細菌數量進行比較時,反映的是產品的抑菌效果。抑菌值會隨不同的測試對照品發生變化,對照品的選擇對正確評價抑菌值有很關鍵的作用。 
4.3.1模擬法
模擬法實驗是模擬產品的實際使用環境、方法、程序,對產品的抗菌效果進行評價。
此方法較為實際客觀,特別是對3.1-3.4法不適用的產品所選者使用,例如氣體狀的殺菌產品,采用3.1-3.4的方法都無法對其進行評價,我們可以采用模擬法,人為制造一個污染空間,對產品使用前后的細菌數量進行檢測,評價產品的殺菌值(率)。
除此之外,對一些洗滌產品我們也可以模擬人皮進行測試,模擬人皮我們可以采用人造皮或動物皮替代,模擬我們的皮膚經過這些產品洗滌或消毒的過程,計算產品使用前后細菌減少。
有一些實驗還可以直接在受試者身上進行,例如EN 1500-1997《化學消毒劑和防腐劑 擦手劑 試驗方法和要求》即采用的是真人的洗手過程,通過對一組12-15人洗手過程中,得到的殺菌率進行數學統計,最后得到產品的殺菌效果評價。
在我們國家消毒技術規范[2008]消毒劑對手消毒模擬現場試驗章節里有許多種,模擬法測試的介紹。企業可以根據自己對產品的需求進行選擇。

結論
抗菌劑和抗菌產品抗菌性能測試的方法具有多樣性,各種方法各有其優缺點。故在抗菌檢測中須根據樣品的各種特性來確定相應的檢測方法,才能使得每個企業能對自己產品的抗菌/殺菌性能有正確
的評價。
 
參考文獻:
[1] L. J. VINSON, E. L. AMBYE, A. G. BENNETT, W. C. SCHNEIDER, AND J. J. TRAVERS. In Vitro Tests for Measuring Antibacterial Activity of Toilet Soap and Detergent Bars. Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 50, No. 10 October 1961
[2]消毒技術規范[2008]
[3] ASTM E 1874-09 Sandard Test Method for Recovery of Microorganisms From skin using the cup scrub technique. Chemical Engineering Science, 1990, 45(8): 2219-2225.
[4] JIS L 1902:2002 Testing for antibacterial activity and efficacy on textile product

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